Ретронім - важлива частина вродженого імунітету бактерій

 Ізраїльські вчені в ході багатоступеневих експериментів розшифрували функції і механізм роботи ретронім - загадкових генетичних елементів у бактерій. Ретронім кодують химерну молекулу, що складається з РНК і одноцепочечной ДНК, і разом з ними - ген зворотної транскриптази. Залишалося загадкою, навіщо бактерії такі дивні химери. Як з'ясувалося, вони здійснюють широку противірусну захист бактерій. На відміну від системи набутого імунітету, пов'язаного з системою CRISPR, ретронім є однією з частин вродженого імунітету у бактерій. До складу ретронім крім попередника комплексу з РНК і ДНК, а також зворотної транскриптази, входить ген ефекторних білка. При інфікуванні бактеріальної клітини цей ефектор активується і дуже швидко вбиває клітину, так що віруси не встигають розмножитися і заразити сусідів. Дане дослідження показує найширші перспективи можливого використання ретронім системи для вирішення як медичних завдань, так і для розуміння еволюції живого світу.

В кінця 80-х років минулого століття в цитоплазмі цікавою соціальної бактерії Myxococcus xanthus були виявлені численні копії одноцепочечной ДНК, не пов'язані з її кільцевої ДНК. При цьому кожен такий шматочок ДНК був двома кінцями причеплений до фрагменту РНК. Стало ще цікавіше, коли з'ясувалося, що ця ДНК зчитується з РНК, а не навпаки - РНК з ДНК. Цей комплекс отримав найменування msДНК (msDNA) - скорочення від multicopy single-stranded DNA.

Зчитування ДНК з РНК каталізується особливим ферментом - зворотною транскриптазою (цей фермент також називають ретро-транскриптазой). Виявилося, що в геномі бактерій ця зворотна транскриптаза зчитується разом з попередником msДНК, складаючи один оперон. Такий оперон назвали ретронім (retrone), зворотна транскриптаза потрібна тут для перетворення РНК-попередника в повноцінну msДНК. Однак призначення дивного химерного комплексу з одноцепочечной ДНК і РНК залишалося загадкою. Було ясно лише, що цю химеру не слід відносити до мобільних елементів, так як на відміну від мобільних елементів ретронім «прописані» в бактеріальної ДНК і не переміщаються з клітки в клітку. У бактерій знайдені десятки ретронім, що розрізняються своєю ДНК-послідовністю.

Група фахівців з інституту Вейцмана (Ізраїль) під керівництвом Ротема Сорек (Rotem Sorek) нарешті розгадали функцію (або, ймовірно, одну з функцій) цієї загадкової композиції. Забігаючи вперед, зауважу, що ця химерна молекула служить для захисту від вірусної інфекції. Якщо CRISPR-система забезпечує бактерії набутий імунітет, то дія msДНК схоже на вроджений імунітет.

Отже, в чому суть дослідження (викладеного на рідкість ясно і послідовно в порядку розвитку самої ідеї).

Вчені почали з пошуку ретро-транскриптаз в клітинах модельного штаму E. coli. Особливу увагу вони приділили так званим «острівців захисту», ділянкам ДНК, де зосереджені гени, що кодують інструменти протистояння різних інфекцій. На цих острівцях розташовуються, наприклад, гени CRISPR. Дійсно, на цих ділянках знайшовся ген ретро-транскриптази, що має, як показав пошук в базах даних, аналоги у безлічі інших бактерій. Разом з ним зчитувався і ген ендонуклеази (вона розрізає ДНК на шматочки). Між ретро-транскриптазой і ендонуклеази розташовувався попередник msДНК. Іншими словами, вчені виявили ретронім.

Природно було припустити, що цей ретронім разом з ендонуклеази, раз вони знаходяться в межах «острівця захисту», виконують разом якусь захисну функцію. Щоб це довести, використовували три виготовлених штаму: з мутантної РНК-частиною, з мутацією в точці початку зворотної транскрипції ДНК (тобто у мутанта була відсутня ДНК-частина химерної молекули) і з мутантної ендонуклеази. Всі три варіанти показали низьку або нульову резистентність до пред'явленим типам вірусів, зате вихідний штам до цих вірусів був стійкий. Так було доведено, що дана зв'язка «ретронім + ендонуклеаза» потрібна для захисту від вірусної інфекції, і що цей захист забезпечується всім комплексом (РНК + ДНК + ендонуклеаза), а не його окремими компонентами.

Наступне питання, що логічно випливає з попереднього ув'язнення: чи можна захисну функцію конкретного ретронім поширювати на інші ретронім? Адже цілком імовірно, що захисною функцією є лише один з них. Відповідь була ствердна: «так, можна, захисну функцію виконує більшість ретронім». Це з'ясували, коли пошукали гомологи зворотних транскриптаз, що входять до складу відомих ретронім в геномах 38 167 бактерій і архей. Знайшлися 4802 таких гомолога, і більшість їх розташовується саме в межах «острівців захисту». Іншими словами, ретронім йдуть в комплекті з іншими захисними системами бактерій. До слова, у архей ретронім присутні лише в 1% з вивчених геномів, тоді як у більшості бактерій вони є.

В ході пошуку по геномних баз даних виявилася ще одна важлива деталь. З'ясувалося, що переважна більшість ретронім зчитується разом з іншими компонентами - ендо- та екзонуклеаза, трансмембранними білками, рібозілтрансферазой і т. Д. Всього виявлено 10 типів таких асоційованих з ретронім добавок - ефекторів. У випадку з першим вивченим ретронім таким ефектором послужила ендонуклеаза. Ретронім, як підкреслюють дослідники, є не двокомпонентну систему, а трикомпонентну, до колишніх двох з необхідністю додається ефектор.

Тепер потрібно було підтвердити захисну функцію ретронім не за допомогою теорії і статистики, а в реальному експерименті. І зауважте, без скоригованого уявлення про будову ретронім як трикомпонентної системи цей експеримент ніколи б не вийшов. А з новим розумінням все пройшло відмінно. Для експерименту взяли 11 ретронім (очевидно, разом з їх ефекторами) і вставили ці комплекси по одному в геном штаму E. coli, що не має ніяких ретронім. Потім вчені стали заражати отримані варіанти E. coli різними вірусами. Вісім варіантів показали високу резистентність до вірусів: частина з них спрацювала проти більшості вірусів, а частина проявила специфічну антивірусну стійкість. Щоб ще більше зміцнити свій висновок про функції саме ретронім системи, вчені застосували версію ретронім з мутацією в ретро-транскриптазе (тобто ефектор був нормальний, а у msДНК була відсутня ДНК), а потім з мутацією в ефектори (тобто ефектор був мутантний, а msДНК - нормальна). В обох випадках інфекція вбила штам, захист виявилася недієвою. Висновок про захисної системі ретронім тепер виглядає надійно обгрунтованим.

Наступний поставлене запитання: як працює ця захисна система? Автори дослідження, спираючись на відомі функції деяких ефекторів, припустили, що ця система тим чи іншим способом вбиває заражені клітини. В результаті такого альтруїстичного самогубства заражена клітина сама гине, але зате інфекція не передається клітинам-сусідам. Це так звана абортивна захист від інфекцій (вона добре вивчена у рослин).

Припущення про абортивної захисту перевірили знову ж експериментально. Штами з нормальним і мутантом ретронім заразили вірусом і подивилися, як буде розвиватися інфекція. В даному випадку ефектором ретронім служив трансмембранний білок, що порушує проникність клітинної мембрани. Коли він спрацьовує, мембрана перестає виконувати свою функцію, і в клітку потрапляє все, що є у зовнішньому середовищі. Це дозволило візуалізувати процес інфекції - в середу додали флуоресцентний барвник, який в клітці набуває червоного кольору. Після інфікування вірусом клітини з мутантним ретронім стали червоними через 45 хвилин, стінки зруйнувалися, клітини розчинилися, віруси вийшли назовні - перший інфекційний цикл закінчився. Клітини з нормальним ретронім почервоніли вже через15 хвилин. При цьому такі клітина гинули ще до завершення вірусного циклу, їх стінки не розчинилися і віруси не вийшли назовні - в результаті зараження зупинилося. Потрібно підкреслити, що це лише один з можливих способів самогубства, адже Ефектори у ретронім різні.

З цього висновку випливає логічно наступне питання: який механізм запуску ефектора? Іншими словами, що відбувається між впровадженням вірусу і початком дії ефектора. Один з можливих посередників був знайдений. Ним виявився білковий комплекс, який має назву RecBCD. Це обов'язковий елемент у бактерій, так як він здійснює репарацію ДНК, бере участь у вставці нових фрагментів вірусних геномів в CRISPR-касети, а також є неодмінним учасником всього іншого противірусного арсеналу бактерії (зокрема кришить на шматочки лінійну подвійну ДНК, ту саму, яку вірус впорскує в клітку). Так що не дивно, що як протидію бактеріальної захисту багато вірусів виробили спеціальні інгібітори саме для комплексу RecBCD. Ці інгібітори у різних вірусів різні, але їх дія спрямована саме на дезактивацію RecBCD.

В експериментах з нормальними і мутантними RecBCD вчені продемонстрували, що ретронім якимось чином пізнає, що RecBCD приведена в неробочий стан. І тут же активує свій ефектор - значить, захист включена. Ймовірно, процес розпізнавання пов'язаний з присутністю одноцепочечной ДНК в химерної msДНК: саме з одним з її ділянок вміє зв'язуватися RecBCD і з цим же сайтом зв'язується вірусний інгібітор, відкріплений RecBCD від msДНК. Однак, як відзначають автори, механізми розпізнавання вірусної інтервенції ретронім можуть бути самими різними і не обов'язково зводяться до зв'язку з RecBCD.

Ясно, що можна і далі ставити запитання, поглиблювати цю тему, розширювати її, але це все ж лише одна стаття. І без того вона дала найширший матеріал для осмислення. Де, як, за яких умов включається вроджений імунітет у бактерій? Чому тут потрібна така дивна химерна молекула? Як ми це можемо застосовувати її (і чи можемо) для наших медичних завдань? Все це, практично напевно, теми найближчих майбутніх відкриттів. Я не побоюся дати прогноз, що тема розшифровки роботи ретронім стане не менш цікавою і несподіваною, ніж це було з системою CRISPR.

Джерело